Рацемизация аминокислот в тканях зуба

Опубликовано: 26.04.2024

Аминокислотное датирование - это метод датирования, используемый для оценки возраста образца в палеобиологии , молекулярной палеонтологии , археологии , судебной медицине , тафономии , осадочной геологии и других областях. Этот метод связывает изменения в молекулах аминокислот со временем, прошедшим с момента их образования.

Все биологические ткани содержат аминокислоты . Все аминокислоты, кроме глицина (простейшего), оптически активны , имея стереоцентр при их атоме α- C . Это означает, что аминокислота может иметь две разные конфигурации, «D» или «L», которые являются зеркальным отображением друг друга. За некоторыми важными исключениями, живые организмы сохраняют все свои аминокислоты в L-конфигурации. Когда организм умирает, контроль над конфигурацией аминокислот прекращается, и отношение D к L перемещается от значения, близкого к нулю, к равновесному значению, близкому к 1, этот процесс называется рацемизацией . Таким образом, измерение отношения D к L в образце позволяет оценить, как давно этот образец умер.

Содержание

1 Факторы, влияющие на рацемизацию
2 используемые аминокислоты
3 Приложения
4 Процедура
5 ссылки
6 Внешние ссылки
- 6.1 Действующие лаборатории

Факторы, влияющие на рацемизацию

Скорость, с которой происходит рацемизация, зависит от типа аминокислоты и от средней температуры, влажности, кислотности ( pH ) и других характеристик вмещающей матрицы . Кроме того, пороговые значения концентрации D / L возникают при внезапном снижении скорости рацемизации. Эти эффекты ограничивают аминокислотную хронологию материалами с известной историей окружающей среды и / или относительными взаимными сравнениями с другими методами датирования.

Истории температуры и влажности микросреды производятся со все возрастающей скоростью по мере развития технологий и накопления данных технологами. Они важны для определения возраста аминокислот, поскольку рацемизация происходит намного быстрее в теплых влажных условиях по сравнению с холодными и сухими условиями. Исследования регионов от умеренного до холодного гораздо более распространены, чем исследования в тропиках, и устойчивый холод океанского дна или сухая внутренняя часть костей и раковин внесли наибольший вклад в накопление данных датирования рацемизации. Как показывает практика, участки со средней годовой температурой 30 ° C имеют максимальный диапазон 200 тыс. Лет назад и разрешение около 10 тыс. Лет назад; сайты с температурой 10 ° C имеют максимальный возраст

2 млн лет и разрешение обычно около 20% возраста; при -10 ° C реакция имеет максимальный возраст

10 млн лет и, соответственно, более грубое разрешение.

Сильная кислотность и щелочность от слабой до сильной вызывают значительное повышение скорости рацемизации. Обычно предполагается, что они не оказывают большого влияния на природную среду, хотя тефрохронологические данные могут пролить новый свет на эту переменную.

Вмещающая матрица, вероятно, является наиболее сложной переменной при датировании аминокислот. Сюда входят различия в скорости рацемизации между видами и органами, а также на глубину разложения, пористость и каталитические эффекты местных металлов и минералов.

Используемые аминокислоты

Обычный рацемизационный анализ обычно показывает соотношение D-аллоизолейцин / L- изолейцин (соотношение A / I или D / L). Это соотношение аминокислот имеет то преимущество, что его относительно легко измерить и его можно использовать в хронологическом порядке через четвертичный период .

Методы обращенно-фазовой ВЭЖХ позволяют измерять до 9 аминокислот, используемых в геохронологии, в разных временных масштабах на одной хроматограмме ( аспарагиновая кислота , глутаминовая кислота , серин , аланин , аргинин , тирозин , валин , фенилаланин , лейцин ).

В последние годы были предприняты успешные попытки исследовать внутрикристаллические аминокислоты отдельно, поскольку было показано, что в некоторых случаях они улучшают результаты.

Приложения

Данные геохронологического анализа рацемизации аминокислот накапливались в течение тридцати пяти лет. Особенно пострадали археология , стратиграфия , океанография , палеогеография , палеобиология и палеоклиматология . Их приложения включают корреляцию датирования, относительное датирование, анализ скорости седиментации, исследования переноса наносов, палеобиологию сохранения , тафономию и усреднение по времени, определение уровня моря и реконструкцию термической истории.

Палеобиология и археология также сильно пострадали. Исследования костей, раковин и отложений внесли большой вклад в палеонтологические данные, в том числе касающиеся гоминоидов. Произошла проверка радиоуглеродных и других методов датирования рацемизацией аминокислот и наоборот. Иногда возможно «заполнение» больших диапазонов вероятностей, например, эффектами резервуара радиоуглерода. Палеопатология и диетический отбор, палеозоогеография и корни, таксономия и тафономия , а также исследования жизнеспособности ДНК имеются в большом количестве. Иногда возможно разделение вареных костей, скорлупы и остатков вареных от сырых. С помощью этого метода были оценены культурные изменения человека и их влияние на местную экологию.

Незначительное снижение этой способности к восстановлению во время старения важно для исследований нарушений разрушения тканей, связанных с долголетием и старостью, и позволяет определять возраст живых животных.

Аминокислотная рацемизация также играет важную роль в исследованиях деградации тканей и белков, что особенно полезно при разработке методов сохранения музеев. Они создали модели белкового адгезива и других повреждений биополимера и одновременного развития системы пор.

Судебная медицина может использовать этот метод для оценки возраста трупа или предмета искусства для определения подлинности.

Процедура

Аминокислотный рацемизационный анализ состоит из подготовки образца, выделения нужной аминокислоты и измерения ее отношения D: L. Подготовка проб включает идентификацию, экстракцию сырца и разделение белков на составляющие их аминокислоты, обычно путем измельчения с последующим кислотным гидролизом. Продукт гидролиза производного аминокислоты может быть объединен с хиральной специфической флуоресцентной системой, разделенной хроматографией или электрофорезом , и конкретное соотношение D: L аминокислоты определяется флуоресценцией. Альтернативно, конкретная аминокислота может быть разделена хроматографией или электрофорезом, объединена с катионом металла , а отношение D: L определено масс-спектрометрией . Хроматографическое и электрофоретическое разделение белков и аминокислот зависит от размера молекулы, который обычно соответствует молекулярной массе, и в меньшей степени от формы и заряда.

Издательство «Медиа Сфера»

Об издательстве
Рекламодателям
Доставка / Оплата
Контакты

ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России, Москва, Россия

Кафедра судебной медицины Первого МГМУ им. И.М. Сеченова

Кафедра судебной медицины Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова, Москва, Россия,119435

Ассоциация специалистов и организаций лабораторной службы "Федерация лабораторной медицины"

Исследование аминокислотного состава зуба в целях судебно-медицинской идентификации личности

Журнал: Судебно-медицинская экспертиза. 2017;60(1): 42-45

Пиголкин Ю. И., Золотенкова Г. В., Веленко П. С., Изотов Б. Н. Исследование аминокислотного состава зуба в целях судебно-медицинской идентификации личности. Судебно-медицинская экспертиза. 2017;60(1):42-45. https://doi.org/10.17116/sudmed201760142-45

В связи с возросшей потребностью в новых подходах к судебно-медицинской идентификации личности проводятся усиленный поиск и разработка точных методов, способных установить общие признаки личности в условиях массового количества пораженных и наличия сильных посмертных изменений, в том числе гниения и значительной фрагментации тела. В статье представлен аналитический обзор, доказывающий, что определение возраста с исследованием аминокислотного состава тканей зуба является перспективным направлением не только в областях археологии и антропологии, но и для идентификации личности в судебной медицине.

Кафедра судебной медицины Первого МГМУ им. И.М. Сеченова

Ассоциация специалистов и организаций лабораторной службы "Федерация лабораторной медицины"

Установление личности граждан по неопознанным трупам является одним из востребованных направлений судебно-медицинской экспертной практики [1]. Особое значение проблема идентификации личности приобрела в последние десятилетия в связи со значительным увеличением количества обнаруживаемых неопознанных трупов с признаками сокрытия преступлений (расчленения, сожжения, утопления, захоронения и т. д.). Увеличению доли тяжких преступлений против личности способствуют изменение социально-экономической обстановки в России, резкое снижение благосостояния населения на фоне отсутствия целенаправленного реформирования правовой политики [2]. Ежегодно на территории РФ, по данным МВД, регистрируется более 20 000 неопознанных человеческих останков, из которых удается идентифицировать только 20—25% [3]. К концу 2005 г. на учете ОВД находилось 69 181 дело по неопознанным трупам. После проведения необходимых розыскных мероприятий не установлена личность более чем 33 000 трупов, т. е. неопознанным остался практически каждый второй труп [4].

Приведенные статистические данные убеждают в актуальности проблемы идентификации личности. В последнее время идентификационные исследования вновь становятся одной из первоочередных задач как у нас в стране [5], так и во всем мире в связи с участившимися случаями крупномасштабных катастроф, локальных военных конфликтов и террористических актов, которые приводят к гибели большого количества людей [6—8].

Как показывает экспертная практика, объектами идентификационных экспертиз по установлению личности человека преимущественно являются расчлененные и обугленные части трупов, костные останки, гнилостно-трансформированные и мумифицированные трупы. В подобных случаях отождествление личности проводят по стоматологическому статусу [3]. Зубы человека имеют большое количество практически неповторимых в своей совокупности признаков, индивидуализирующих личность. Эти признаки обладают значительной стойкостью к различным неблагоприятным физико-химическим факторам, температуре и гнилостной трансформации. Данное обстоятельство имеет решающее значение для судебно-медицинской экспертизы. В связи с этим стоматологические методы отождествления личности, помимо активного использования в экспертной работе, продолжают совершенствоваться.

В судебно-медицинской литературе приводятся сведения о возможности использования достаточно широкого спектра анатомо-морфологических признаков, рентгенографического изображения зубов и челюстей, фотографий, слепков и моделей зубов для идентификации личности [3, 9]. В экспертной практике используют прижизненные дентальные рентгенограммы, ортопантомограммы, так как формы и относительные размеры рентгеновского изображения зубов, а также их корней, наличие кариозных полостей, пломб, протезов и других приобретенных особенностей индивидуальны [10—12]. Однако использование анатомо-морфологических особенностей строения зубов при идентификации личности зачастую крайне ограничено, так как полностью зубные ряды сохраняются достаточно редко, что приводит к потере способности идентифицировать личность с их помощью. По отдельным зубам тем не менее можно определить большинство общих признаков личности, в том числе возраст. Зубы, как и кости, в процессе жизни человека подвержены не только заболеваниям, но и инволюционным изменениям, благодаря которым их можно использовать в качестве материала для установления биологического возраста. Одним из многообещающих подходов к определению возраста является исследование аминокислотного состава твердых тканей зуба.

Зуб образован твердыми (эмаль, дентин, цемент) и мягкими (пульпа) тканями [13]. Большая часть зуба состоит из дентина — вещества, непрерывно продуцирующегося в течение всей жизни человека и представленного дентиновыми трубочками с отростками одонтобластов и основным веществом, которое состоит из коллагена и минеральных солей. В области корня дентин покрыт цементом, напоминающим грубоволокнистую соединительную ткань из волокон коллагена и солей кальция, а в области коронки — эмалью. Эмаль зуба состоит из эмалевых призм, скрепленных основным веществом. Гомогенность и высокая степень минерализации делают эмаль одной из наиболее прочных тканей человека.

Доля органических веществ в зрелой эмали около 1,5—3%, а в дентине составляет 28—30%. В твердых тканях зуба представлены белки, липиды и полисахариды. По аминокислотному составу белки эмали напоминают строение кератинов и содержат серин, оксипролин, глицин, лизин. Белки дентина имеют строение, типичное для коллагена: большое количество глицина, пролина и оксипролина и отсутствие серосодержащих аминокислот [13].

В тканях зуба, как и во всем организме, аминокислоты белков имеют исключительно L-форму. Поддерживающаяся в полости рта температура около 37 °C способствует постепенному переходу некоторых аминокислот в D-изомер, т. е. процессу рацемизации. Установлено, что при указанной температуре скорость этой реакции составляет примерно 0,1% в год [14, 15]. В настоящее время данный факт нашел широкое применение в археологии и антропологии [16—19] для определения возраста костных останков и окаменелостей: вычисляют содержащееся в них соотношение D- и L-изомеров аминокислот. Основоположниками данного метода принято считать сотрудника института океанографии Стриппса в Сан-Диего J. Bada [14, 15], а также P. Hare, R. Mitterer и P. Abelson [20—22], которые в 1967—1969 гг. опубликовали ряд статей по изучению аминокислотного состава в окаменелых раковинах морских существ.

В судебной медицине данный метод используется для определения возраста неизвестного человека по твердым тканям зуба [23—25]. В 1975 г. P. Helfman и J. Bada [15] показали прямую зависимость между температурой и степенью рацемизации белков эмали зуба и предположили возможность применения полученных данных для установления возраста личности. R. Griffin и соавт. [26] исследовали 31 здоровый зуб и 13 кариозно-измененных зубов, взятых у людей известного возраста. Авторы установили возраст каждого человека, который отличался от реального на 6,2—8,7 года. Такую большую погрешность результатов они объяснили гетерогенностью белков эмали, а также различным количеством эмали на разных зубах, хотя есть исследования [27—29], показывающие, что степень рацемизации аминокислот зависит и от типа зуба. Среднее значение содержания D-аспарагиновой кислоты в зависимости от типа зубов уменьшается в следующем порядке: первый моляр > второй моляр > второй премоляр > первый премоляр > клыки > центральные резцы > боковые резцы [27].

Низкая точность определения возраста по аминокислотному составу эмали зуба вызвана и рядом других причин. С возрастом эмаль стирается, изнашивается, иногда подвергается значительным кариозным изменениям. Помимо этого, эмаль сильнее всего подвергается значительным температурным перепадам в полости рта, поэтому отличие рассчитанного возраста от реального может достигать 11 лет [30].

В отличие от эмали дентин зуба меньше подвергается возрастным и кариозным изменениям, а также температурным воздействиям. В связи с этим ряд зарубежных авторов [12, 22, 25, 28, 29] рекомендуют использовать для исследования именно дентин. Рацемизация аспарагиновой кислоты в дентине дает более точное и адекватное представление о возрасте зуба. J. Bada и P. Helfman [14] исследовали образцы дентина. Так, в 1976 г., измерив D/L — соотношение аспарагиновых кислот в 20 образцах зубов доноров от 11 до 75 лет, авторы пришли к выводу, что по сравнению с эмалью аминокислотный состав дентина является более надежным индикатором возраста. Позже были опубликованы предложения по модификации данной методики [24, 27, 31, 32]. A. Teivens и соавт. [33] исследовали 51 зуб от доноров 3—86 лет. Точность определения возраста человека, несмотря на сильную корреляцию между возрастом зуба и количеством D-аспарагиновой кислоты (0,97), составила ± 12 лет.

V. Carolan и соавт. [24] показали сильную корреляцию возраста зуба со степенью рацемизации в дентине глутаминовой и аспарагиновой кислот и серина. Они отметили, что скорость реакции глутаминовой кислоты несколько ниже, чем других аминокислот, что приводит к некоторым погрешностям в результатах. Авторы собрали большую коллекцию зубов людей известного возраста, провели их исследование и получили высокую достоверность результатов. Помимо зубов современных людей, они изучили 8 образцов дентина от останков XVIII—XIX веков; рассчитанный возраст отличался от реального на 12 лет. S. Ohtani [34] изучал рацемизацию аспарагиновой кислоты в дентине, используя его поперечные и продольные срезы. В итоге корреляция D/L-соотношение содержания изомеров и возраста оказалась несколько выше в продольных срезах дентина (r=0,995), чем в поперечных (r=0,984—0,987). Установили, что в дентине зубов от более молодых доноров степень рацемизации аминокислот выше в коронке зуба и на верхушках корней. С возрастом эта разница исчезает. Ввиду такого различия автор рекомендует использовать продольные срезы.

А. Sacuma и соавт. [35] рекомендуют исследовать зуб целиком, поскольку в этом случае методика подготовки образцов значительно упрощается. Исследовали 12 пар клыков нижней челюсти от доноров известного возраста, при этом в каждой паре для определения степени рацемизации аминокислот один зуб готовили в целом виде, а из второго выделяли дентин. Метод исследования зуба целиком менее точен (погрешность составила ±7,4 года), однако простая процедура анализа может быть использована для стандартизации изучения аминокислотного состава в тканях зуба.

Проведенный нами аналитический обзор источников литературы доказывает, что степень рацемизации аспарагиновой кислоты в дентине дает достаточно точное и адекватное представление о возрасте зуба. Выявлены основные проблемы существующих методик: отсутствие стандартизации, а также трудоемкая процедура подготовки образцов. Необходимо искать оптимальное сочетание точности метода с простотой его исполнения.

Таким образом, исследования в направлении изучения возможности использования рацемизации аспарагиновой кислоты в дентине зуба в комплексе с другими методами для установления возрастного интервала при проведении судебно-медицинских идентификационных экспертиз являются, на наш взгляд, перспективными. Применение данного метода обеспечит системный подход и учет всей информации, которая могла бы в конечном счете повысить точность экспертного заключения. В настоящее время решение основных идентификационных задач невозможно без широкого и комплексного использования достижений различных отраслей наук, так как лучшие прикладные результаты достигаются на стыке пограничных научных дисциплин. В процессе идентификации личностей неопознанных трупов необходимо строго дифференцировать место и значение различных методов исследования, определить их последовательность, оценить достоверность полученных результатов, выявить вопросы, требующие дополнительной научной разработки.

Конфликт интересов : авторы статьи подтвердили отсутствие финансовой поддержки/конфликта интересов, о которых необходимо сообщить.

Издательство «Медиа Сфера»

Об издательстве
Рекламодателям
Доставка / Оплата
Контакты

Ассоциация специалистов и организаций лабораторной службы "Федерация лабораторной медицины"

Кафедра аналитической и судебно-медицинской токсикологии Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова Минздрава России, Москва, Россия, 128018

Кафедра судебной медицины Первого МГМУ им. И.М. Сеченова

Методика исследования биохимического состава твердых тканей зуба человека

Журнал: Судебно-медицинская экспертиза. 2019;62(5): 39-42

Изотов Б. Н., Веленко П. С., Лисовская С. Б., Золотенкова Г. В., Башилов А. А. Методика исследования биохимического состава твердых тканей зуба человека. Судебно-медицинская экспертиза. 2019;62(5):39-42. https://doi.org/10.17116/sudmed20196205139

Ассоциация специалистов и организаций лабораторной службы "Федерация лабораторной медицины"

В мировой литературе нет единого подробного стандарта исследования биохимического состава зуба. Данное обстоятельство послужило поводом к разработке собственной методики определения энантиомеров аспарагиновой кислоты в твердых тканях зуба для дальнейшего изучения связи аминокислотного состава тканей с биологическим возрастом человека. Образцы зубной ткани, полученные от живых лиц в возрасте от 20 до 50 лет, изучали методом хромато-масс-спектрометрии. Полученные результаты позволили выдвинуть ряд практических рекомендаций по стандартизации процедуры подготовки образцов зубной ткани и параметров хромато-масс-спектрометрического исследования.

Ассоциация специалистов и организаций лабораторной службы "Федерация лабораторной медицины"

Кафедра судебной медицины Первого МГМУ им. И.М. Сеченова

Проблема определения возраста неопознанного человека до сих пор представляет собой область большого научного интереса исследователей [1—3]. Причина этого — отсутствие единого подхода к определению возраста, который отвечал бы всем требованиям судебно-медицинской практики отождествления личности. Метод должен быть достаточно точен и универсален, а методика — простой и легковоспроизводимой во всех судебно-медицинских учреждениях. Процедура установления возраста не должна занимать слишком много времени или ресурсов [4].

Оценка возрастных изменений костей и стоматологического статуса человека давно используется в судебно-медицинской практике [5, 6]. Наибольшую актуальность исследование этих тканей приобретает в случаях фрагментации тел и выраженных посмертных изменений [7, 8].

В настоящее время одним из наиболее надежных методов определения возраста по зубам является исследование аминокислотного состава твердых тканей зуба [9]. Установлено, что в течение жизни человека в его зубах с постоянной скоростью происходит трансформация L-аспарагиновой и некоторых других аминокислот в D-изомер (рацемизация аминокислот). Зная константу скорости рацемизации, можно вычислить возраст зуба и соответственно возраст его обладателя.

В мировой литературе отсутствует подробное описание методики аналитического исследования аминокислотного состава зуба. В единичных работах зарубежных ученых показано, что биологический возраст коррелирует с ln (1+D/L) или ln<(1+D/L)/(1-(D/L)>, где (D/L) — соотношение D- и L-форм аспарагиновой кислоты твердых тканей зуба, однако цифровые значения показателя сильно различаются [1, 9—11]. Данное обстоятельство послужило поводом для собственного исследования: разработать стандартизованную процедуру получения образцов твердых тканей зуба и провести их хроматографическое изучение.

Цель исследования — разработка методики установления форм аспарагиновой кислоты в твердых тканях зуба человека для последующей оценки их возрастной динамики. Задачи исследования включали определение параметров подготовки образцов зубной ткани для аналитического исследования и хроматографический анализ производных энантиомеров аспарагиновой кислоты в твердых тканях зуба, а также разработку стандартизованного подхода к изучению биохимического состава зубов человека.

Материал и методы

Для исследования выбрали здоровые коренные зубы, удаленные у пациентов стоматологических клиник в возрасте от 20 до 50 лет для исправления окклюзии либо после механической травмы. Все доноры зубов дали письменное согласие на исследование. Всего отобрали 5 зубов, чтобы из одного зуба изготовить несколько образцов. От доноров женского пола в возрасте 20, 23, 23 и 35 лет получили 4 премоляра, от донора мужского пола 50 лет — один моляр. До начала подготовки образцов зубной ткани донорский материал хранили в условиях пониженной температуры (3 о C) во избежание дополнительной термоиндуцированной рацемизации аминокислот.

Подготовка проб для хроматографического исследования включает очистку зубов, получение образцов твердой ткани, их взвешивание, гидролиз и дериватизацию аминокислот. После механической очистки от крови, слюны и мягких тканей зубы погрузили на 1 ч в водный раствор натрия гипохлорита (NaOCl) с содержанием активного хлора 12% для уничтожения бактерий и примесей, способных повлиять на результат хроматографии. Отмытые дистиллированной водой и просушенные до постоянной массы зубы измельчили в ступке пестиком, а затем разделили на необходимое количество образцов.

Гидролиз измельченных тканей зуба проводился 6 М метанольным раствором HCl в течение 12 ч при комнатной температуре (21 о С). Для получения полного деривата аспарагиновой кислоты после гидролиза использовали один из трех дериватизирующих агентов: трифторуксусный ангидрид, хлорид пентафлюоробензоила и хлорид 3,5-бис (трифлюорометил)бензоила.

Хроматографическое исследование проводили на газовом хроматографе Agilent 6850 с использованием хиральной колонки с фазой 20% циклодекстрина в метилполисилоксане (35% фенил) Agilent CP-Chirasil-20 beta 19091 GB233 (30 м × 0,25 мм 0,25 мкм) и масс-селективным детектором 5973N (тип детектора квадрупольный, температура квадруполя 150 °C, ионного источника 230 °С), режим работы детектора устанавливали по стандартной программе AUTOTUNE. Градиентное хроматографирование согласно заданным условиям, температура инжектора 210 °C, ввод пробы в режиме «splitless», газ-носитель — гелий, температура интерфейса 230 °C, задержка 3 мин, интервал сканируемых масс в скрининге 29—550 m/z.

Исследование проводили в два этапа. На 1-м этапе вычисляли массу образцов, достаточную для достоверного результата на хроматограмме. Для этого из тканей двух зубов доноров в возрасте 23 лет изготовили по 5 проб массой 5, 10, 50, 100 и 200 мг. На 2-м этапе с учетом полученных результатов из зубов от доноров 20, 35 и 50 лет изготовили по 6 проб, которые разделили по 2 образца для каждого дериватизирующего агента. Также приготовили 3 пробы из смеси чистых D- и L-аспарагиновой кислоты (Sigma-Aldrich) в качестве стандарта. С использованием стандартов в SCAN-режиме изучили масс-спектры полных дериватов D- и L-аминокислот и получили интенсивность сигналов ионов в зависимости от отношения массы к заряду (m/z). В связи с относительно низким содержанием в зубной ткани изучаемых веществ для идентификации сформировали SIM-режим и провели поиск дериватов в анализируемых образцах зубной ткани по основным характеристическим ионам.

Результаты и обсуждение

Формы аспарагиновой кислоты по приведенной методике обнаружили во всех пробах, однако пробы, отобранные в количестве 5 мг, оказались недостаточно информативными при хроматографическом исследовании. Пробы по 10, 50, 100 и 200 мг на хроматограммах динамически различались между собой в наглядности и информативности. В ходе 1-й части исследования выяснили, что наилучший ответ на хроматограмме демонстрируют образцы с большим количеством дентина в пробе. Именно поэтому в дальнейшем при измельчении зуба выбирали в ультрафиолетовом свете только фрагменты дентина в количестве 10 мг.

В результате хроматографического разделения получили данные о времени выхода дериватов аспарагиновой кислоты: 8,171 мин для L-аспарагиновой и 8,317 мин для D-аспарагиновой с достоверным разделением пиков на хроматограмме (рис. 1).
Рис. 1. Разделение пиков диметиловых эфиров D- и L-изомеров аспарагиновой кислоты в дентине на хроматограмме.

По масс-спектрам производных аспарагиновой кислоты, образующихся в ходе дериватизации, вычислили характеристические ионы ее дериватов: m/z 159, 102 (осн), 88 для диметилового эфира аспарагиновой кислоты; m/z 173, 155 (осн), 117 для диизобутилового эфира аспарагиновой кислоты; m/z 189, 130 (осн), 116, 98 для диметилового эфира N-диметил аспарагиновой кислоты; m/z 189, 130, 116 (осн), 98 для диметилового эфира N-метил аспарагиновой кислоты. Указанные массы облегчают обнаружение пиков искомых веществ на хроматограмме и существенно повышают точность исследования при изучении тканей зуба (рис. 2).
Рис. 2. Масс-спектрограмма диметилового эфира аспарагиновой кислоты, полученная при исследовании зубной ткани.

В процессе дальнейшей оптимизации методики изучили различные варианты пробоподготовки. Основная методика изготовления образцов твердых тканей зуба для исследования аминокислотного состава заключается в обработке 6 М раствором хлористоводородной кислоты (HCl), при этом гидролиз проходит в течение 12 ч при температуре 110 о С [9—11]. После гидролиза кислоту удаляют в роторном испарителе либо под вакуумом, улавливая щелочью (NaOH). Отметили, что изменение концентрации хлористоводородной кислоты как в сторону концентрирования, так и в сторону разбавления в процессе гидролиза приводит к резкому снижению извлечения (процент выхода) аминокислот из дентина зуба. В то же время использование 6 М раствора хлористоводородной кислоты в метаноле позволило снизить температурный режим гидролиза, так как длительное температурное воздействие в агрессивной среде не только индуцирует процесс рацемизации аминокислот, но и снижает хроматографическую «чистоту» исследуемого образца, что может оказать существенное влияние на точность установления биологического возраста. Оптимальные результаты гидролиза достигнуты при температуре 37 о С в течение 6 ч и без температурного воздействия (при комнатной температуре 21 о С) при воздействии в течение 12 ч. Для экспресс-исследования в случае массового поступления образцов допустимо брать навеску дентина не менее 20 мг и проводить гидролиз при температуре 50 о С в течение 2 ч. Для растворения стандартов D- и L-форм аспарагиновой кислоты использовали метанольный раствор хлористоводородной кислоты (HCl) в соотношении 9 частей спирта и 1 часть концентрированной HCl. В указанных условиях протекает процесс частичной дериватизации по карбоксильным группам аспарагиновой кислоты, что облегчает ее хромато-масс-спектрометрическое исследование. Установлено, что стандарты аминокислот труднее растворимы при повышении атомности спирта (от метилового до бутилового), и для их полного растворения требуется нагревание, что является нежелательным и должно быть минимальным по времени.

Заключение

По результатам исследования определили возможность использовать аминокислотный состав дентина для установления возраста человека в условиях стандартной биохимической лаборатории. Газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией позволяет определять стереоизомеры аспарагиновой кислоты, содержащиеся в твердых тканях зуба. Сведения об обнаруженных особенностях аминокислот в тканях зуба отсутствуют как в отечественной, так и в зарубежной литературе. С учетом установленных нами стандартов пробоподготовки и параметров хромато-масс-спектрометрического анализа методика оценки степени рацемизации аспарагиновой кислоты является легковоспроизводимой. Это позволяет рекомендовать ее для исследования возрастной динамики биохимического состава зубов человека.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Содержание

1 Факторы, влияющие на рацемизацию
2 используемые аминокислоты
3 Приложения
4 Процедура
5 ссылки
6 Внешние ссылки
- 6.1 Действующие лаборатории

Факторы, влияющие на рацемизацию

2 млн лет и разрешение обычно около 20% возраста; при -10 ° C реакция имеет максимальный возраст

10 млн лет и, соответственно, более грубое разрешение.

Используемые аминокислоты

Приложения

Процедура

Эта группа препаратов используется для ускорения восстановительных процессов в организме.

В процессе жизнедеятельности организма клетки, прежде всего короткоживущие (клеточные элементы крови, эпителиальные клетки слизистой оболочки полости рта, желудочно-кишечного тракта и покровного эпителия кожи) и их функциональные элементы (нервные волокна, сократительные белки и т.д.), постоянно заменяются. Для осуществления физиологической регенерации необходимо стимулировать клеточное деление и биосинтез пуриновых и пиримидиновых оснований, нуклеиновых кислот, структурных и ферментных белков, фосфолипидов, формируемых из составных частей пищи (аминокислоты, моносахара, незаменимые жирные кислоты, витамины, микроэлементы и т.д.). При недостаточном питании нарушаются трофические процессы в тканях, возникает дефицит энергии, необходимой для биосинтетических процессов. При этом у пациентов развивается та или иная патология.

Восстановление структуры и функции органа после заболеваний, травм, чрезмерной нагрузки и т.д. обозначают термином "репаративная регенерация". Для стимуляции этого вида регенерации следует прежде всего устранить повреждающий агент, убрать нежизнеспособные ткани и учесть другие факторы, тормозящие регенерацию (стресс, воспаление, инфекция, перегружающие зубочелюстную систему протезы, недостаточная витаминная обеспеченность, нарушение кровоснабжения органов и тканей и т.д.).

В основе фармакологической регуляции процесса регенерации лежит стимуляция белкового синтеза и активация защитных механизмов, обеспечивающих функционирование организма как единого целого.

Для стимуляции процессов регенерации могут быть использованы различные группы лекарственных препаратов:

1. Витаминные препараты (особенно пластического обмена - кислота фолиевая, витамины В 12 , B 6 , B 1 , С, А, U и др.).

6. Неспецифические стимуляторы регенерации растительного и животного происхождения (масло облепихи, масло шиповника, каротолин, масло пихты, апилак, прополис, перга, румалон, церебролизин, актовегин, солкосерил и др.).

Влияние на процессы регенерации витаминных препаратов, стероидных анаболических средств и иммуномодуляторов рассматривается в соответствующих разделах ("Витаминные препараты", "Гормональные препараты", "Средства, влияющие на систему иммунитета").

К нестероидным анаболическим средствам относят препараты, стимулирующие биосинтез нуклеиновых кислот (субстратная активация). Это либо предшественники пуриновых или пиримидиновых оснований, либо продукты частичного гидролиза нуклеиновых кислот. В отличие от стероидных анаболических препаратов они не обладают гормональной активностью и имеют низкую токсичность.

Инозин ( рибоксин ) - предшественник адениловых и гуаниловых нуклеотидов и калия оротат - предшественник пиримидиновых оснований. Применяют их в основном при заболеваниях печени и миокарда.

Достаточно часто назначают натрия дезоксирибонуклеат ( натрия нуклеинат ) и метилурацил ( метацил ). Стимулируя метаболические процессы, синтез нуклеиновых кислот и белковый обмен, анаболические средства ускоряют размножение и рост клеток, восстановление массы и функции поврежденных органов и тканей, активируют лейкопоэз, повышают лейкоцитарную активность, способствуют образованию антител, лизоцима, комплемента, пропердина, интерферона, оказывают противовоспалительное действие. Они не только ускоряют регенерацию, но и улучшают ее качество, способствуя заживлению раневых и язвенных поверхностей, делая рубец более эластичным, восстанавливая функцию ткани.

Процессы регенерации усиливают так называемые биогенные стимуляторы. К ним относят препараты животного или растительного происхождения, содержащие вещества, как правило, неустановленной природы, оказывающие стимулирующее влияние на организм и ускоряющие репаративные процессы. Считают, что подобные вещества образуются в переживающих и изолированных тканях для адаптации к неблагоприятным условиям.

Стимулируют процесс регенерации масло облепихи и масло шиповника , содержащие ненасыщенные и насыщенные жирные кислоты, каротиноиды, токоферолы, витамины группы В, С, Р и другие органические вещества. Местно (аппликации) их применяют для ускорения заживления ран, ожогов, трофических и радиационных язв, трещин и т.д. Внутрь масло облепихи и шиповника используют при язвенной болезни желудка и у онкологических больных после химиотерапии и облучения. Соки, отвары, настои и настойки из ряда лекарственных растений (зверобой, каланхоэ, подорожник большой, кровохлебка лекарственная, окопник лекарственный, ноготки лекарственные, сушеница болотная, софора японская и др.) стимулируют процессы регенерации, оказывают антибактериальное и противовоспалительное действие, в связи с чем их применяют в виде аппликаций, "ванночек", полосканий при лечении инфекционно-воспалительных заболеваний слизистой оболочки полости рта и горла, для улучшения заживления раневых и ожоговых поверхностей.

Продукты пчеловодства - апилак (маточное молочко пчел), прополис (пчелиный клей), мед и перга (мед с высоким содержанием пыльцы растений) оказывают стимулирующее влияние на регенерацию, улучшают трофические процессы в тканях, снимают спазмы сосудов, обладают антибактериальным действием, повышают иммунитет. Их используют для лечения длительно незаживающих ран, язв, афт, эрозий.

Активными стимуляторами регенерации являются безбелковые препараты, получаемые из крови крупного рогатого скота, солкосерил и актовегин . Их используют в виде мази, желе или геля местно для улучшения обменных процессов и ускорения регенерации при язвенно-некротических процессах, ожогах, травмах.

В неврологии и травматологии широко используются тканеспецифические стимуляторы регенерации - церебролизин (при заболеваниях нервной системы) и румалон (при дистрофии хряща, при длительно незаживающих переломах).

Применяется внутрь (во время или после еды), в комплексной терапии заболеваний пародонта и слизистой оболочки полости рта, при длительно незаживающих язвах, переломах; местно - в виде 5-10% мази.

Выпускается в порошке; в таблетках по 0,5 г; 10% мази в тубах по 25 г.

Вводится в переходную складку полости рта (для стимуляции процесса регенерации при заболеваниях пародонта) и подкожно (при хронических воспалительных процессах).

Выпускается в ампулах по 1 мл.

Применяется местно, внутримышечно. внутривенно или внутриартериально.

Выпускается в ампулах по 2 мл; желе и мази в тубах по 20 г.

Читайте также: